Ariefatoes’s Weblog











{November 7, 2008}   PCR

<!– @page { size: 21cm 29.7cm; margin: 2cm } P { margin-bottom: 0.21cm } A:link { color: #0000ff } –>

Gambarkan bagaimana PCR dilakukan tekankan pada pentingnya primer dan temperatur yang digunakan.

Nama:

Anindita Dyahsinta (B1J006022)

Sulistiyani (B1J006026)

Arifatus Sholikhah (B1J006028)

Kelas: B1

E-mail: adyahsinta@yahoo.com

E-mail: lin2_cut3@yahoo.com

E-mail: caava_riefa@yahoo.co.id

kode tugas : K39-TD-10

RINGKASAN

Pengertian PCR

PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.

Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya saja pada teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran secara berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan (Brown, 2002).

PCR adalah proses enzimatik dimana suatu area spesifik dari DNA direplikasikan berulang-ulang untuk menghasilkan banyak kopi dari sekuen tertentu. Pengkopian molekuler ini meliputi proses pemanasan dan pendinginan sampel dalam suatu siklus panas tertentu yang melebihi dari 30 siklus.

( gambar 1 )

Dalam setiap periode siklus, sebuah kopi dari sekuen target DNA tersebut dihasilkan untuk setiap molekul yang mengandung sekuan target.

.

( gambar 2 )

Keterbatasan dari produk ini ditegaskan dengan oligonukleotida primer yang melengkapi buntut 3’- dari sekuen tersebut.

Proses PCR memerlukan sejumlah siklus untuk mengamplifikasi suatu sekuens DNA spesifik. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing (hibridisasi), dan ekstensi (polimerasi)

(gambar 3).

1. Denaturasi

Denaturasi dilakukan pada suhu 90-95°C, sehingga terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (template) tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase.

2. Annealing

Selanjutnya, suhu diturunkan untuk penempelan primer oligonukleotida pada sekuens yang komplementer pada molekul DNA cetakan. Tahap ini disebut annealing. Suhu campuran diturunkan sampai mencapai ~55°C atau sesuai melting temperature (Tm) dari primer oligonukleotida (Glick & Pasternak, 2003). Selama tahap ini, primer berpasangan dengan sekuens komplementernya di dalam DNA cetakan. Primer oligonukleotida melekat pada masing-masing utas tunggal DNA dengan arah yang berlawanan; satu primer melekat pada ujung untai DNA sense, sedangkan primer yang lain melekat pada ujung utas DNA antisense.

3. Ekstensi

Tahap selanjutnya adalah tahap ekstensi yang dilakukan pada suhu 72°C. Suhu ini merupakan suhu optimum untuk kerja enzim Taq DNA polimerase. Pada tahap ini enzim Taq DNA polimerase mengkatalis reaksi penambahan mononukleotida pada primer yang sesuai dengan utas DNA komplemen yang berada di sebelahnya. Suhu pada setiap tahap diatur sedemikian rupa sehingga dihasilkan amplifikasi sekuens target DNA yang efisien.

(gambar 4 : http://aquamina.files.wordpress.com/2008…)

Model primer yang baik adalah mungkin komponen yang paling penting pada reaksi PCR yang baik. Bagian target pada kerangka DNA yaitu ditetapkan dengan posisi primernya. Hasil PCR berpengaruh langsung terhadap karakteristik primer tersebut. Agar PCR bekerja dengan efisien, kedua primer harus spesifik pada bagian target, memiliki kekuatan suhu yang mirip, tidak berinteraksi secara berarti dengan lainnya.

Ada 2 komponen terpenting dari reaksi PCR, yaitu sekuen DNA pendek atau sisi area yang akan dikopi. Tindakan utama adalah untuk mengidentifikasi atau menentukan target dari cetakan DNA yang akan dikopi. Yang mengendalikan reaksi PCR adalah oligonukleotida yang diciptakan secara kimiawi dan ditambahkan dalam konsetrasi yang tinggi ke dalam cetakan DNA. Beberapa pengetahuan tentang rangkaian DNA yang tercetak dibutuhkan untuk rangkaian primer yang sesuai.
Komponen lain dari reaksi PCR terdiri dari kerangka DNA yang akan dicetak, membangun blok dengan membentuk ke empat nukleutida, dan DNA polimerase bergabung dengan blok pada dasar dari rangkaian kerangka DNA.

Panas mengawali PCR bisa menunjukkan dengan memperkenalkan komponen reaksi yang kritis seperti polimerase, setelah suhu pada sampel akan dinaikkan dengan menguatkan temperatur tsb. Barangkali lebih penting adalah tabung sampel harus dibuka pada saat siklus suhu untuk memperkenalkan komponen esensial, di mana memberikan kesempatan yang lebih besar untuk kontaminasi silang di antara sampel. Pembahasannya pada sesi lain, bentuk modifikasi dari Taq DNA polimerase akan ditingkatkan yang membutuhkan aktivasi suhu dan memungkinkan tabung panas tertutup mengawali PCR, enzim ini dinamakan AmpliTaq Gold, yang memiliki mutu yang besar pada PCR.

PCR adalah prosedur yang secara langsung dan ini kadang-kadang sulit untuk dijelaskan mengapa ini menjadi begitu penting dalam penelitian modern. Pertama kita akan menentukan dengan pendekatan bagian batas DNA untuk menjadi luas yang harus diketahui. Ini berarti bahwa PCR tidak dapat digunakan untuk membersihkan dari gen atau bagian lain dari genom itu yang tidak pernah pelajari sebelumnya. Batasan yang kedua adalah rantai panjang DNA yang dapt dikopi. Bagian dari 5kb dapat diperluas tanpa banyak kesulitan, dan pemberasan yang lebih panjang-diatas 40 kb-mungkin digunakan untuk modifikasi tentang teknik standar. Bagaimanapun juga, fragmen yang lebih besar dari 100 kb diperlukan untuk proyek sekunsing genom yang diperoleh dengan teknik PCR.

Aplikasi PCR

Primer merupakan produk yang menggambarkan segmen tunggal dari suatu genom dapat diperolah dari sejumlah DNA sampel yang berbeda. PCR digunakan dengan cara yang serupa seperti pada pengambilan DNA sampel pada manusia untuk mutilasi yang dihubungkan dengan penyakit genetik sepertu thalassemia dan cystic fibrosis. Ini juga merupakan bentuk basis bagan keturunan, dimana variasi di dalam microsatelit panjang merupakan tipenya. Gambaran kedua tentang PCR adalah kemampuan PCR untuk bekerja sama dengan bagian yang sangat kecil pada pemulaian sintsesis DNA. Dengan demikian PCR juga dapat digunakan untuk memperoleh sekuen dari beberapa jejak DNA yang terdapat dalam rambut, bloodstains dan spesimen forensik lain, dan dari tulang dan sisa yang diperoleh dari situs arkeologi.

(Gambar 5)

Ilmu pengetahuan forensik dan laboratorium penulis DNA mendapat keuntungan yang besar sejak ditemukan teknik yang dikenal sebagai reaksi rantai polimerase ( PCR ). Tanpa adanya kemampuan untuk membuat kopi dari sampel DNA, banyak barang bukti forensik yang tidak mungkin dapat dianalisa. DNA dari TKP seringkali terbatas dalam jumlah dan kualitasnya, dan untuk mendapatkan sampel yang bagus dan lebih murni adalah sulit ( para pelaku kejahatan tentunya tidak akan secara sengaja meninggalkan bukti ). Teknologi penjabaran DNA dengan menggunakan PCR adalah cocok sekali untuk menganalisis sampel DNA forensik karena metode ini sensitif, cepat, dan tidak seperti metode RFLP ( Restriction Fragment Lenght Polymorphism ) yang terbatas penggunaanya dalam hal kuantitas (Brown, 2002).

Dalam diagnosa klinis, PCR mampu mendeteksi kehadiran DNA virus dengan baik sebelum virus menjangkau level yang diperlukan untuk menginisiasi respon penyakit. Bagian yang umum pada awal identifikasi kehadiran virus-kanker diinduksi karena sebagai program perawatan yang dapat diinisiasi sebelum kanker terbentuk. Uraian diatas hanya menggambarkan sedikit aplikasi dari PCR. Kini teknik ini menjadi bagian yang utama dari molekuler ilmu biologi dan kita akan menemukan banyak lagi contoh yang dapat digunakan untuk mempelajari genom (Brown, 2002).

Brown, T.A (2002) DNA in Genomes, 2nd ed.,

http://www.pcrstation.com/invers-pcr/

http://www.pcrstation.com/pcr-primer/

http://www.pcrstation.com/hot-start-pcr/

http://www.pcrstation.com/

http://reaksichainpolimerase.blogspot.com/

Advertisements


<!– @page { size: 21cm 29.7cm; margin: 2cm } P { margin-bottom: 0.21cm } A:link { color: #0000ff } –>

Perbedaan Kandungan Gen pada Genom Eukariotik Berbeda dan Pengertian Multigen Family

Nama: Arifatus Sholikhah

Nim: B1J006028

Kelas: B1

E-mail: caava_riefa@yahoo.co.id

Blog: https://ariefatoes.wordpress.com

Topik: B1-AG5

RINGKASAN

Eukariot merupakan organisme yang mempunyai inti sejati yang mengandung bagian terbesar dari genom-genom. Genom terbagi dalam sejumlah kromoson yang dipisah setelah terjadi penggandaan pada peristiwa mitosis. Genom eukariot terdiri atas genom nuklear dan genom mitokondria, sedangkan pada tanaman ditambah dengan genom kloroplas. Perbedaan utama struktur genom antar eukariot yang berbeda terletak pada ukuran genom. Setiap organisme yang berbeda mempunyai ukuran genom yang berbeda pula. Sepintas tampaknya ukuran genom berkorelasi dengan kompleksitas organisme. Organisme yang berukuran besar ukuran genomnya pun semakin besar pula. Seperti pada vertebrata dan tanaman berbunga yang memiliki ukuran genom lebih besar jika dibandingkan dengan fungi yang merupakan eukariot paling sederhana. Namun kenyataannya peningkatan kompleksitas organisme tidak selalu diikuti oleh peningkatan ukuran genom. Fenomena ini dikenal dengan C-value paradox. Pada organisme sederhana (kurang kompleks) ruang-ruang didalam genom dimanfaatkan dengan sangat efisien karena gen-gen dikemas dengan padat.

Contoh:

  1. Genom bakteri kurang lebih 12 Mb (0.004 dari ukuran genom manusia). Bila proporsi kandungan gen pada genom bakteri dan manusia sama, maka jumlah gen bakteri adalah 0.004 x 35.000 gen = 140 gen. Kenyataannya bakteri memiliki sekitar 5.800 gen.

  2. Perbandingan segmen sepanjang 50 kb antara yeast, drosopila dan manusia menunjukkan bahwa genom yeast merupakan genom yang paling efisien diikuti oleh drosopila dan manusia (jumlah gen: yeast > drosopila > manusia; jumlah intron dan genom wide repeat: yeast < drosopila < manusia). Bila dibandingkan dengan prokariot, segmen 50 kb bakteri lebih efisien dibandingkan yeast (Gbr 1).

Ukuran genom untuk beberapa organisme eukariotik adalah sebagai berikut

Spesies

Ukuran Genom (Mb)

Fungi

Saccharomyces cerevisiae

12.1

Aspergillus nidulans

25.4

Protozoa

Tetrahymena pyriformis

190

Invertebrates

Caenorhabditis elegans

97

Drosophila melanogaster

180

Bombyx mori (silkworm)

490

Strongylocentrotus purpuratus (sea urchin)

845

Locusta migratoria (locust)

5000

Vertebrates

Takifugu rubripes (pufferfish)

400

Homo sapiens

3200

Mus musculus (mouse)

3300

Plants

Arabidopsis thaliana (vetch)

125

Oryza sativa (rice)

430

Zea mays (maize)

2500

Pisum sativum (pea)

4800

Triticum aestivum (wheat)

16 000

Fritillaria assyriaca (fritillary)

120 0

Perbandingan genom pada manusia, Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, Jagung dan Eschercia coli.

gambar di atas merupakan gambar segmen 50 Kb lokus reseptor pada sel T β pada manusia dan membandingkan dengan segmen 50 Kb dari genom Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, Jagung dan Eschercia coli.

Segmen 50 kb jagung yang memiliki ukuran genom 5000 Mb lebih besar dari manusia hanya memiliki 1 gen. Mayoritas segmen ini mengandung genome wide repeat (tipe LTR). Secara keseluruhan genom wide repeat menyusun 50% genom jagung. Dalam sejumlah spesies sejumlah genom wide repeat mengalami penggandaan secara ekstensif. Karena itu ukuran genom dapat sangat bervariasi diantara organisme yang sederajat. Contoh protozoa Amoeba dubia memiliki ukuran genom lebih dari 200 000 Mb, sementara protozoa lainnya 100 – 500 kb. Serangga cricket memiliki ukuran genom 11 kali lebih besar dibandingkan sesama insek lalat buah.

Multigen family adalah gen-gen yang terdapat dalam organisme yang sama yang dapat mengkode sekuen protein. Setiap eukariot mengandung banyak salinan gen2 yang menyandi non-coding ribosomal RNA (rRNAs). Genom manusia mengandung kira-kira 2000 gen untuk 5S rRNA, semuanya terletak berkelompok pada kromosom 1. Juga terdapat kira2 280 salinan sekuens berulang yang mengandung gen2 28S, 5.8S dan 18S rRNA, terbagi dalam 5 kelompok 50 – 70 repeat pada kromosom 13, 14, 15, 21 dan 22.

Daftar Pustaka

Brown, T.A (2002) DNA in Genomes, 2nd ed.,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.section.5234

diakses tanggal 25 September 2008.

Situs terkait

http://www.horizonpress.com/gateway/multigene-families.html



{September 5, 2008}   Hello world!

Welcome to WordPress.com. This is your first post. Edit or delete it and start blogging!



et cetera